Molekylær genetisk forskningsmetode

For å utforske og identifisere varianter i DNA-konstruksjon som benyttes molekylær genetisk metode. For hvert DNA-region, som utforsker denne region av kromosomet, gen eller allel, fremgangsmåtene er forskjellige. Liggende under hver molekylær genetisk metode omfatter en eller annen manipulering av RNA og DNA. Alle disse fremgangsmåter er karakterisert ved en enorme kompleksitet, uten laboratorieforhold ikke kan utføres, og personalet må være høyt kvalifisert. Dette arbeidet blir utført i flere etapper.

stadier

Først, RNA eller DNA-prøver som skal fremstilles. Her kan en molekylær genetisk metode anvendes på praktisk talt alle materialer: en dråpe blod, leukocytter, fibroblaster kultur, slimhinner (skraping), og med hårsekkene, - DNA kan oppnås fra en hvilken som helst prøve. Det er passende å anvende noen molekylære genetiske metoder og deres ulike alternativer og har isolert DNA blir lagret i frossen tilstand. Det andre trinn er dedikert til akkumulering av de ønskede fragmenter (forsterkning) av DNA, da den bidrar til å sikre polymerasekjedereaksjonen in vitro (in vitro uten involvering av levende organisme). Som et resultat av de utvalgte DNA-fragment som multipliserer med denne kjedereaksjon, og mengden av DNA øker bokstavelig talt millioner av ganger.

Det tredje trinnet i de molekylære genetiske forskningsmetoder antas multipliserte DNA-restriksjons (denne fragmentering, riving eller skjæring). Begrensning utført ved elektroforese på en polyakrylamid eller agarosegel. Dette molekylærgenetisk metode for å studere DNA-fragmentet kan alle ta en viss posisjon i gelen. Deretter blir gelen behandlet med etidiumbromid, i stand til binding til DNA, bestråling med ultrafiolett lys, så er det mulig å observere luminescens porsjoner. Molekylærgenetiske diagnostiske fremgangsmåter er varierte og tallrike, men de to første trinn er felles for alle. Men for å identifisere DNA-fragmenter, kan gelen farget, og mange andre eksisterende metoder.

arter

Den mest direkte og utbredte fremgangsmåter for påvisning mykobakterier kan omfatte de ovennevnte molekylære genetiske DNA læringsmetode. Sin essens er det, for å identifisere den skanne kjeden materiale av spesifikke DNA-fragmenter av patogener. Molekylærgenetiske diagnostiske teknikker ikke ennå har en mer effektiv måte for å gjenkjenne slike sykdommer som tuberkulose. Bruke polymerase chain reaction (PCR), kan du være sikker på at den opprinnelige DNA vil øke antall kopier i en million ganger, det vil si, det vil være forsterkning, og det vil vise resultatene. Følsomhetsnivået er meget høy - mer enn nittifem prosent, noe som er den største fordelen med denne fremgangsmåten.

Resten av molekylærgenetiske metoder for forskning på effektiviteten av utbyttet av flere kopier bokstavelig talt fordoblet, da det i dette tilfelle å utforme prøven viser en spesifikk oligonukleotidsekvens øket til ett hundre og seks ganger. Selv kulturen diagnostisering av tuberkulose i luftveiene i stor grad redusere dens følsomhet. Dette er grunnen til moderne medisin er basert på molekylære genetiske metoder for diagnose av tuberkulose. En beskrevet metode er effektiv, spesielt ved håndtering av patogener av høy antigenisk variabilitet, bestemme den andre måten er mye vanskeligere - krever spesielle næringsmedier og dyrke lang tid. Biokjemiske og molekylærgenetiske metoder gir meget forskjellig virkning på resultatene.

diagnose av tuberkulose

Marshall PCR diagnostisering av tuberkulose oftest ved hjelp av de DNA-sekvensene som er spesifikke for alle fire typer av sykdommen. For å oppnå dette målet ofte bruke primere som gjenkjenner sekvensen er elementer (IS-986, IS-6110), som disse elementer karakter vandrende art Mycobacterium tuberculosis og alltid byr på flere kopier i genomet. Også DNA-ekstraksjon kan utføres fra rene kulturer og klinisk (sputum fra pasienter) ved en hvilken som helst annen egnet metode. For eksempel er det Boom-metoden hvor den lyseringsbufferen blir brukt basert på den guanidintiocyanat og silika som bærer-DNA. Antallet pasienter som skiller dårlig bakteriologisk øker hvert år, og derfor i klinisk praksis har etablert et helt annet nivå av organisasjonen: molekylær-genetisk metode for å studere DNA har spilt en viktig rolle i diagnostisering.

Men vi må innrømme at det er ikke uten ulemper. PCR-metoden er bruk av ofte bringer et stort antall falske positive resultater, og grunnen er ikke bare tekniske feil, men også de funksjonene i selve metoden. I tillegg bruker denne metoden for diagnose for å bestemme levedyktigheten av mykobakterier, som har blitt identifisert, er det rett og slett umulig. Men denne ulempen er ikke det viktigste. Molekylærgenetiske metoder for PCR-diagnostikk medfører risiko for forurensning av mycobakterie-DNA. Sertifiseringskrav på grunn av dette at for PCR laboratorier designet eksklusivt vanskelig, krever de tre separate lokaler. PCR-teknologien er moderne og svært komplekse, det krever bruk av riktig utstyr og opplært personell oppskalere.

bacterioscopy

Når diagnose resultatene av analysen må sammenlignes med andre data: klinisk undersøkelse, radiografi, mikroskopi, beskjære og til og med respons på en spesifikk behandling er meget viktig. I denne serien er PCR-studiene bare en av komponentene. Oppdage patogenet i tidlig diagnose kan være den enkleste og raskeste metodene - bakteriologiske.

Det blir brukt et lysmikroskop (farging Ziehl-Neelsen) og fluorescerende (farve fluorokromer). Fordelen er hastigheten smøre resultatene. Men dens ulempe er rette ansett begrenset kapasitet på grunn av lav følsomhet. Imidlertid er denne metode som er beskrevet WHO anbefaling som den mest økonomiske og bakken for å detektere tuberkulose. Påvisning av mykobakterier bakteriologiske metode har prediksjon verdi og beregnet kvantitativt bakteriell utskillelse. Mye mer trygg på å håndtere det molekylærgenetiske forskningsmetoder tuberkulose.

kulturer

Bedre påvisning av mykobakterier gjenkjenne kulturstudier. Såing patologisk materiale den er laget inn i egge medium: Mordovsky, Finn II, LJ, og lignende. Referansemålinger av motstand av mykobakterier til medisiner og indirekte bevis på effektiviteten til en rekke av mykobakterier og deres kolonier in vitro, hvis den anvendte metode for forskning kultur. For å øke andelen av isolering av mykobakterier inokulering av patologisk materiale holdes på flere miljøer.

Møte behovene til mange kulturelle, patogen inkludert tilskudd og væsker. Brukes i dette systemet og automatisert måling typen VANTES vekst. Avlinger må holdes i inkubasjon i opptil sju til åtte uker. På denne tiden avlingen med mangel på vekst kan betraktes som negative. Den mest effektive måten å detektere Mycobacterium tuberculosis vurdere biologiske prøver: diagnostiske materiale Infisere marsvin, som er svært utsatt for TB.

noen tall

Interessant fagområde, som ble åpnet ved PCR-diagnostikk var å studere M. tuberculosis - latent infeksjon. Det moderne begrepet TB infeksjon antyder at av hundre mennesker som var i kontakt med M. tuberculosis, nitti kan godt være smittet, men bare ti av dem er aktiv sykdom er under utvikling. Andre har TB immunitet, og på grunn nitti prosent av tilfellene infeksjonen forblir latent. Detektere et mønster det har bidratt til en molekylær genetisk metode.

Geneticists si at femtifem prosent av de som avlinger patologisk materiale var negativ, og åtti prosent av personer som er infisert med M. tuberculosis, men flyter uten radiografiske manifestasjoner av sykdom, fikk PCR-positive responser. Det er en genetisk diagnostisk metode bidratt til å identifisere pasienter som er utsatt ved PCR-studier med resultatene av deres analyser (mikroskopi og kultur) ble negativ, og subklinisk infeksjon M. tuberculosis var til stede.

moderne forskning

Russland og bakteriologiske laboratorier bruker en akselererende metode for absolutte konsentrasjoner: nitrat-reduktase-aktiviteten av mykobakterier testet av Griess-reagens. Anti-tuberkulose sentre bruke en metode som gjør det mulig å bestemme medikamentresistens. Dette seeding i flytende medier, hvor automatisert radiometriske og fluorescerende regnskapssystem vekst av mykobakterier. En slik analyse utføres raskt - opp til to uker.

For tiden, er nye fremgangsmåter blir utviklet: medikamentresistens av mykobakterier måles ved genotypen nivå. Studie av de molekylære mekanismer for resistensgener og viser tilstedeværelse i mycobakterier. Disse gener er forbundet med resistens mot visse legemidler. For eksempel, Kasa gener, INHA, katG motstandsdyktig mot isoniazid, rpoB gene - rifampicin 16Sp RNA gener og rpsL - streptomycin, emb1 - til etambutol, Gyra - en fluorquinolon og så videre.

mutasjoner

Den moderne diagnose betydelig økt molekylærgenetisk nivå metode for å studere DNA og tillates å utføre storskala studier av mutasjoner i alle deres spektrum. Nå vet vi at de mest vanlige mutasjoner i 516, 526 og 531 kodon den rpoB genet, og identifisert motstanden mot ulike rusmidler. Det er en hel rekke metoder for typing av mykobakterier ved hjelp av ikke bare tradisjonelle metoder - biokjemiske, biologiske og kultur, men også mye brukt moderne molekylærgenetiske teknikker. Det er allerede tilstrekkelig og gi riktig diagnose metode for påvisning av monogene sykdommer. De er basert på DNA-studier i det nøyaktige område av et bestemt gen. Dette er vanligvis en kompleks prosess, tidkrevende og kostbare, men de data som er gitt av molekylær genetisk analyse, er mye mer nøyaktig og informativ enn dataene for alle andre analyser.

Det har lenge vært kjent at DNA ikke endres for hele livet av organismen som det er i alle celler med kjerne odnakova, og dette gjør det mulig å ta analyse av absolutt alle cellene i kroppen, på ethvert stadium av ontogeny. Den skadede genet kan oppdages før utseendet av de første symptomene til fullskala klinisk sykdom, så vel som hos friske heterozygote folk, men å ha en mutasjon i genet. Molekylærgenetiske arvelig sykdom diagnostiske metoder tillater å avsløre dens (direkte fremgangsmåte, DNA-diagnostikk), så vel som for å analysere segregering av sykdommen i familien med markør loci DNA (genetiske polymorfismer), som er nært knyttet sammen med en skadet gen (dvs. den indirekte løsning av DNA-diagnostikk). Direkte eller indirekte - eventuelle DNA-diagnostikk er basert på metoder for å identifisere en strengt definert del av det humane DNA.

direkte metoder

Direkte metoder for DNA-diagnose, er når den skyldige genet arvelig sykdom som er kjent, som vel kjent, og typer av dens mutasjoner. For eksempel, et egnet direkte metoder i en rekke sykdommer. Dette Huntingtons chorea (forlengelse CTG-gjentakelser), fenylketonuri (R408W), cystisk fibrose (delF508, store mutasjoner) og lignende. Den største fordelen med den direkte metoden er en heleid diagnostisk treffsikkerhet, og det er ikke nødvendig for å gjøre DNA-analyse av resten av familien. Hvis en mutasjon i det tilsvarende genet blir funnet, lar det nøyaktig godkjenne en diagnose av arv, genotype bestemmelse for resten av tyngede familien.

En annen fordel med direkte diagnose anses å identifisere en heterozygot bærer av dårlige mutasjoner fra slektninger og foreldre som døde av sykdommen. Dette gjelder spesielt for sykdommer autosomal recessiv. Ulemper ved direkte metoder også er tilgjengelige. Å bruke dem, må du vite nøyaktig lokalisere det unormale genet, exon-intron struktur i sitt spekter og sine mutasjoner. Ikke alle monogene sykdommer i dag har mottatt slik informasjon. Informativeness direkte metoder kan ikke betraktes som fullstendig, fordi en og samme genet kan ha et stort antall patologiske mutasjon som forårsaker utvikling av arvelige sykdommer.

indirekte metoder

Indirekte metoder i DNA-diagnostikk brukes i det hele tatt, i andre tilfeller, hvis den skadede genet ikke er identifisert, men bare kromosomer, eller hvis linjen diagnosen ikke gi resultatet (det skjer, dersom genet komplekse molekylære organisasjon eller stor grad, hvis det er mye patologiske mutasjoner). Indirekte metoder utføres segregering analyse av polymorfe markører i allelisk familien. Markører som finnes i det samme kromosomale region eller locus er nært knyttet til sykdommen og representerer delesjoner eller insersjoner, punkt substitusjoner, gjentas, og deres polymorfisme er på grunn av forskjellig mengde celler i blokken.

Mest hensiktsmessig for indirekte diagnose anses mikro og minisatelitt polymorfismer, som er vidt utbredt i det humane genomet. deres verdi uttrykt i høy informasjonsinnhold, dersom skade på genetiske avstanden mellom markør og genet ikke er for stor. I det sistnevnte tilfellet, er dette gjort nøyaktighet bestemmes i stor grad frekvensen for rekombinasjon mellom det polymorfe markør og skader. Indirekte diagnostiske metoder gir også obligatorisk innledende trinn av allel frekvenser av den analyserte populasjonen studie blant pasienter og bærere av mutasjoner, samt nødvendigheten av å bestemme sannsynligheten for rekombinasjon av nonequilibrium og adhesjons-markører og mutante alleler.

andre fremgangsmåter

Korte segmenter av RNA eller DNA, så vel som enkelt gen visualisert under mikroskopisk undersøkelse ikke kan, derfor, for å identifisere mutasjoner som trengs av molekylær genetisk diagnose. Det er en "Human Genome Project", så vel som andre fremskritt innen molekylær genetikk sterkt utvidet muligheten for diagnostisering av arvelige sykdommer - både pre- og postnatal. Disse metodene kan gi en tidlig deteksjon og gjøre et anslag poly- og monogene sykdommer, hvis debut finner sted i voksen alder. Dessverre, på grunn av de tekniske mulighetene i molekylærgenetiske studier er ofte utover de etiske grensene som er satt i forhold til arv, spesielt når diagnosen er i ungdomsårene og barndommen.

Strukturelle og numeriske kromosomale abnormiteter er de mest vanlige årsakene til sykdommer og kreft, og mange misdannelser. Kromosomavvik må identifiseres, noe som er viktig for familievernet - å vurdere prognosen, sammen med reproduktive risiko i fremtidige svangerskap. Kromosomanalyse er den "gullstandard" av genetiske diagnose, men det er begrenset. Bare de metoder for molekylær genetisk analyse kan gjøre mer, fordi det benyttes kloningsteknologi basert fluorescensmarkører som kan deres høye følsomhet til å identifisere små kromosomale endringer som er umulig å oppdage klassiske cytogenetisk studier. Disse teknikkene er stadig utvide våre diagnostiske evner, når undersøkt, barn med utviklingshemming, mental retardasjon, med mange andre arvelige sykdommer.

funn

Det er meget viktig for menneskeheten var genet struktur og funksjon av kunnskap, typer av variabilitet, evnen til å påvise arvelige sykdommer som oppsto i forbindelse med utviklingen av molekylærgenetikk. dens metoder er rettet mot studiet av DNA-molekylet - og når det er normalt, og når det er skadet. Fremstilling av deoksyribonukleinsyre sekvenser av nukleotider (DNA) strekker seg i trinn fra å motta prøver for å identifisere individuelle fragmenter. Isolering av genomisk DNA fra cellene, begrensning (rivning), forsterkning (kloning), elektroforese av fragmentene (separering av deres elektriske ladning og molekylvekten ved hjelp av agarose-gel). Identifisering av spesifikke fragmenter som befinner seg på overflaten av en diskret stripe.

Deretter kommer inn i act spesielle filtre, gjennom hvilken det passerer hvert fragment hybridisering med klonede DNA-fragmenter eller syntetiske radioaktive prober er en kontroll, som vil være lik for hver testprøve. Hvis man endrer stilling eller lengde i forhold til sonden, hvis en ny fragment eller forsvant - alt dette tyder på at det analyserte genet har gjennomgått omstillinger i nukleotidsekvensen. Det er åtte grunnleggende teknikker i molekylærgenetiske studier: sekvenserings (bestemmelse av DNA-sekvensen), polymerase kjedereaksjon (økning i antallet sekvenser), fremstillingen av primere kjente gener, kloningen DNA, fremstilling av rekombinante molekyler avledede proteiner på grunn av rekombinante molekyler, noe som skaper et fullstendig sett (samling bibliotek) klonede fragmenter som ble oppnådd ved anvendelse av restriksjons.