Fluorescensmikroskopi: prinsippene for den fremgangsmåte

Absorpsjon og re-emisjonen av lys ytterligere uorganiske og organiske væsker er et resultat av fosforescerende eller fluorescens. Forskjellen mellom de fenomener er varigheten av intervallet mellom absorpsjon og emisjon av lys flux. Når fluorescensen av disse prosessene skjer nesten samtidig, mens fosforescens - med en viss forsinkelse.

historisk informasjon

I 1852, britisk vitenskaps Stokes, først beskrevet fluorescens. Han introduserte en ny periode som følge av forsøkene med flusspat, som avgir rødt lys under ultrafiolett lys. Stokes bemerket et interessant fenomen. Det er funnet at den bølgelengden til den fluorescerende stråling er alltid større enn strømmen av eksitasjonslyset.

For å bekrefte hypotesen i det 19. århundre har det vært mange forsøk. De viste at en rekke prøver fluorescens under påvirkning av ultrafiolett lys. Blant de materialer, blant annet vært krystaller, harpikser, mineraler, klorofyll, rå droger, uorganiske forbindelser, vitaminer, oljer. bare direkte bruk av fargestoffer for biologiske tester begynte i 1930

Fluorescens mikroskopi: description

Noen av materialene som brukes i første halvdel av det 20. århundre studiene viste høy spesifisitet. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Takket være den ytelse, som ikke kunne oppnås ved kontrasterende fremgangsmåter har fremgangsmåten ifølge fluorescens mikroskopi blitt et viktig verktøy i biomedisinsk og biologisk forskning. Like viktige resultater ble oppnådd, og for materialer.

? Hvilke fordeler gjør metoden for fluorescens mikroskopi? Ved bruk av nye materialer har blitt mulig og utvalget av svært spesifikke celle submicroscopic komponenter. Fluorescensmikroskopi kan detektere enkle molekyler. En rekke fargestoffer tillate identifisering av flere elementer samtidig. Til tross for den begrensede romlig oppløsning av diffraksjonsgrensen av utstyret, som i sin tur er avhengig av de spesifikke egenskapene til prøven, identifisering av molekyler under dette nivået er også fullt mulig. Ulike prøver etter bestråling utstillings autofluorescence. Dette fenomenet er mye brukt i petrologi, botanikk, halvlederindustrien.

funksjoner

Studere dyre vev eller patogener ofte kompliserte eller for svake eller svært sterke uspesifikke autofluorescence. Imidlertid kan verdien i studier overtar innføring i materialkomponenter som eksiteres ved en spesifikk bølgelengde og emittere lys den nødvendige strømningsintensitet. Fluorokromer virke som farvestoffer som er i stand til uavhengig å festet til strukturer (synlig eller usynlig). Således har de en høy selektivitet til målet, og kvanteutbyttet.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescens mikroskopi har vært mye brukt siden advent av naturlige og syntetiske fargestoffer. De besatt visse belastningsprofiler i sender og eksitasjon og rettet mot bestemte biologiske mål.

Identifisering av individuelle molekyler

Ofte under ideelle forhold, kan du registrere et separat element glød. For dette, blant annet, er det nødvendig å tilveiebringe en tilstrekkelig lav Støyen til detektoren og den optiske bakgrunn. Fluorescein-molekylet til svikt på grunn av fotobleking kan avgi opp til 300 tusen. Fotoner. Ved 20% samlet virkningsgrad av prosessen, og kan registrere dem i en mengde av ca. 60 tusen.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescensmikroskopi basert på lavinefotodioder eller elektroniske multiplikasjon, tillot forskerne å observere oppførselen til individuelle molekyler gjennom den andre, og i noen tilfeller til og med minutter.

kompleksitet

Et sentralt spørsmål i favør av undertrykkelse av optisk støy bakgrunn. På grunn av det faktum at mange av de materialene som brukes i utformingen av filtre og linser viser noen autofluorescence, innsatsen til forskere i de tidlige stadiene ble orientert til produksjon av komponenter med lav fluorescens. Imidlertid har senere eksperimenter førte til nye konklusjoner. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Spesielt ble det funnet at fluorescens mikroskopi, basert på total intern refleksjon, den gjør det mulig å oppnå en lav bakgrunn og høy intensitet eksitasjonslys.

mekanisme

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Prinsippene ved fluorescens mikroskopi, basert på total intern refleksjon er bruken av transiente bølger eller evanescent. Det skjer på grensen mellom medier med forskjellige brytningsindekser. I dette tilfellet, passerer lysstrålen gjennom prismet. Den har en høy brytningsindeks parameter.

Prismet tilstøtende til den vandige oppløsning eller glass med lavt parameter. Dersom en lysstråle som er rettet mot den i en vinkel som er mer kritisk, blir strålen fullstendig reflekteres fra grenseflaten. Dette fenomenet i sin tur fører til nonpropagating bølger. Med andre ord, hvor den genererte elektromagnetiske felt som trenger inn i et medium med en lavere brytningsindeks parameter til en avstand som er mindre enn 200 nanometer.

Den transiente bølger intensiteten til lyset ville være tilstrekkelig til å eksitere fluoroforer. Men på grunn av sin ekstremt liten dybde, vil volumet være svært liten. Resultatet er en lav-nivå bakgrunn.

modifikasjon

Fluorescensmikroskopi er basert på total indre refleksjon, kan implementeres med epi-belysning. Dette krever linser med høy numerisk apertur (minst 1,4, men det er ønskelig at det oppnås 1,45-1,6), og delvis opplyst felt apparat. Det sistnevnte er oppnådd med en liten flekk størrelse. For å oppnå større ensartethet ved hjelp av en tynn ring, som er blokkert av en del av strømmen. For den kritiske vinkelen, etter som det er en total refleksjon, trenger vi en høy grad av brytning av nedsenking medium i linsen og dekkglass av mikroskopet.